近日，浙江大學醫(yī)學院附屬邵逸夫醫(yī)院、浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院等 15 家醫(yī)院聯(lián)合杰毅生物開展的，針對肺部感染患者的定量宏基因組檢測多中心研究取得重要進展，研究成果正式發(fā)表于 《Journal of Infection》（2020 年影響因子 6.072）。論文第一作者為浙江大學附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科周華主任和杰毅生物研發(fā)部歐陽川博士，通訊作者為浙江大學醫(yī)學院附屬邵逸夫醫(yī)院副院長、感染科主任俞云松教授和杰毅生物醫(yī)學部負責人劉超博士。

研究背景

病原宏基因組檢測（mNGS）是基于下一代測序技術(shù)（NGS）對標本中的核酸進行無差別的高通量測序，再與微生物基因序列數(shù)據(jù)庫比對分析，實現(xiàn)了非靶向的泛病原體檢測，具有靈敏度高、檢測周期短、不依賴培養(yǎng)等優(yōu)點。但由于其無偏倚測序的特性，mNGS 獲得的信息中包括標本中的病原體和大量的人源宿主，進而影響了病原體的檢測敏感性。盡管去人源/去宿主技術(shù)可在一定程度上提高 mNGS 的敏感性，但同樣存在非特異性損失病原體的風險。

圖 1. 微生物序列數(shù)（PCR 建庫、PCR-free 建庫）與標本人源細胞數(shù)量成反比

本研究收集了浙江省 15 家醫(yī)院 205 名疑似肺炎且排除 RNA 病毒感染的患者入組，每位患者取肺泡灌洗液后分成兩份進行檢測（一份去人源，一份不去人源）。

肺炎患者 Q-mNGS 檢測

研究者設計并測試了 5 種不同長度和核苷酸序列（與任何已知生物的基因組無顯著同源性）作為內(nèi)標分子（spike-in internal control，簡稱 spike），用來監(jiān)測標本中人源與微生物核酸的載量。模擬實驗顯示，spike 序列數(shù)與投入量呈正相關(guān)，但與人源細胞數(shù)呈負相關(guān)。

圖 2. spike RPM 隨標本人源細胞數(shù)量的增加而降低

研究者在每個 BALF 標本中加入等量的 spike 1，繼而進行 mNGS 測序，并同時采用 AO/PI 雙熒光染色法進行有核細胞計數(shù)，以評估 spike 序列數(shù)與有核細胞計數(shù)之間的關(guān)聯(lián)。結(jié)果顯示， spike 序列數(shù)與細胞計數(shù)呈負相關(guān)，人源指數(shù)（H index）與細胞計數(shù)呈正相關(guān)，人源指數(shù)（H index）可以有效反應標本中人源核酸的含量。

圖 3. Spike 序列數(shù)，人源指數(shù)（H?index）與有核細胞計數(shù)的相關(guān)性分析

考慮到人源含量影響 mNGS 檢測敏感性，研究者對常規(guī) mNGS（不去人源）和去人源后 mNGS 檢測（差異化裂解）進行對比。結(jié)果顯示，差異化裂解去人源會同時造成某些微生物序列數(shù)上升，某些微生物序列數(shù)下降，對細菌和分枝桿菌的富集作用較病毒和真菌更明顯。94.79% 的標本去人源前后的結(jié)果一致，但 8 例（8/205, 3.90%）標本在常規(guī) mNGS 檢測時結(jié)果為陰性，而在去人源后 mNGS 檢測結(jié)果為陽性，其中包括 4 例結(jié)核分枝桿菌、2 例煙曲霉和 2 例白色念珠菌。去人源后造成損失的病原體主要為耶氏肺孢子菌（2 例，RPM 分別下降 7695.87 和 8397.47）。

圖 4. 入組標本的人源指數(shù)以及去人源對微生物序列數(shù)的影響

研究者對 mNGS 用于感染/非感染性疾病的診斷性能進行了分析，205 例患者中有 15 例（7.32%）為非感染性疾病，190 例為感染性疾病，其中 115 例（60.53%）發(fā)現(xiàn)了明確病原學依據(jù)。在 115 例患者中，mNGS 的陽性率為 93.04%（107/115），顯著高于臨床常規(guī)檢測（細菌、真菌培養(yǎng)，G/GM/GXM 試驗，抗酸染色，Xpert 等）的陽性率 49.57%（57/115）。mNGS 共為 123 例患者做出（60.00%）明確診斷，其中 64 例患者，mNGS 結(jié)果為唯一診斷依據(jù)，顯著多于常規(guī)檢測（8 例）。另外，研究發(fā)現(xiàn) mNGS 陰性結(jié)果也有助于臨床排除感染，本研究通過 mNGS 明確非感染診斷 14 例（93.3%），包括間質(zhì)性肺炎 6 例、肺癌 4 例、心臟衰竭 1 例、過敏性肺炎 1 例、慢阻肺（COPD）1 例和放射性肺炎 1 例。

圖 5. 入組患者檢測結(jié)果及臨床診斷結(jié)果

總結(jié)

mNGS 因其無偏倚、非靶向的特性，在鑒定疑難、危重、特殊感染方面相較常規(guī)病原學檢測方法具有顯著優(yōu)勢，但標本中人源含量會影響 mNGS 對于病原體的檢測敏感性，而差異化裂解技術(shù)在提升微生物檢測性能的同時，也會造成一些微生物序列的減少、甚至丟失，因此需要仔細評估和謹慎執(zhí)行，不建議對所有標本無差別使用。

Q-mNGS 原理解析

mNGS 對于病原體的檢測敏感性受標本中人源核酸含量影響，在相同測序數(shù)據(jù)量下，標本中人源核酸含量越高，mNGS 檢測到的人源序列就越多，即檢測到的病原體序列就越少，對于病原體的檢測敏感性就越差，甚至會導致漏檢或假陰性。

Q-mNGS 在對標本進行檢測前，在每份標本中加入等量的 spike，并與標本中其他核酸（人源核酸、病原體核酸）一起進行檢測，因此以 spike 序列信息作為參照，將人源和病原體核酸進行相對定量，獲得標本中真實的人源核酸和病原體核酸含量，以識別高人源下的假陰性和低人源下的真陰性，選擇性的對高人源標本進行去人源，提升檢測陽性率，同時降低去人源造成的病原體損失，還可以協(xié)助臨床進行病原體的載量監(jiān)控和病程管理。

圖 6. Q-mNGS 通過 spike 定量人源和病原體核酸